整体卵巢冷冻及移植的研究进展

      【摘要】 卵巢组织冷冻是保存女性生育能力和内分泌功能的一种极具潜力的方法。卵巢组织移植后的缺血损伤导致卵泡大量丢失，同时由于小块卵巢组织所含的卵泡少，因此移植术后难以长久维持卵巢功能。整个卵巢行显微血管吻合移植术可避免移植后的缺血性损伤。适宜的整体卵巢的冷冻保存方法是施行整体卵巢移植的难点，目前未有统一的标准方法。综述国内外对整体卵巢冷冻及移植的研究进展，探讨如何选择合适的冷冻方法。

      近年随着医疗水平的不断提高，新的放、化疗方案用于 治疗肿瘤患者，大剂量放、化疗药物和骨髓移植可治疗90% 以上的年轻女性肿瘤患者。卵巢组织对放、化疗药物很敏感，治疗同时可造成卵巢不可逆损伤，从而导致女性生殖内分泌功能减退，甚至卵巢早衰。目前，由于冷冻保存技术的发展，卵细胞冷冻、胚胎冷冻、卵巢组织冷冻移植技术可在一定程度上保存女性患者的生育力。卵母细胞冷冻对无配偶的女性患者及由于法律、宗教等限制不能进行胚胎冷冻的患者是很好的选择，但目前技术不够成熟，冷冻效果不稳定， Oktay 等报道其出生率仅为 2%。目前胚胎冷冻是保存女性生育力较成熟的方法，已广泛应用于临床，但不适用于青春期前及无配偶的女性患者。上述两种方法虽可解决女性患者的生育问题，却无法使患者恢复内分泌功能，而且需耽误一定时间去获得可供保存的卵子和胚胎，故不适用于需立即治疗的肿瘤患者。相比之下，卵巢组织冷冻移植无伦理方面限制，且可保存更多的未成熟卵泡使患者恢复生殖内分泌功能。因此，卵巢组织冷冻移植更具优势。用于冷冻移植的卵巢组织可以是卵巢皮质的片段、带血管蒂的整体卵巢。卵巢皮质片段冷冻及移植是目前研究较广泛的方法，具有取材容易、体积小、冷冻保护剂易于渗透、 可多次移植且无伦理学方面的限制等特点。自 2004 年 Donnez 等报道了世界首例通过卵巢皮质片段自体原位移植后获得活产女婴以来，现已报道有超过60 例患者冷冻卵巢组织并在治疗后行卵巢自体移植，有 26 例妊娠并得到活产儿。虽然卵巢皮质片段组织已成功冷冻移植并成功妊娠，但卵巢皮质片段移植不能使患者永久恢复内分泌功能。主要有两个原因:卵巢片段所含有的卵泡数量有限; 无血管吻合的卵巢皮质片段移植后须经血管重建过程才能恢复血供，因此卵巢组织在移植早期恢复血供前就一直处于缺血缺氧状态，从而影响移植后卵泡的存活和卵巢组织的寿命，进而影响女性内分泌及生育力的恢复。Bagis 等研究表明， 完成卵巢皮质组织移植的手术很快，但新血管形成期间的局部缺血可持续3 ～7 天，在此期间 50%或更多的原始卵泡和 几乎所有生长中卵泡都会发生消失。Oktay 等也得出相似结论，冻融卵巢片段移植术后在新生血管生成前，有 70%的 卵泡死亡，这将缩短移植后的卵巢组织具有功能的时间，因而限制了冻融卵巢组织片段的临床应用。为解决卵巢组织移植后缺血问题，许多学者先后尝试了在移植前加入维生素 E、血管生成因子及抗氧化剂等期望改善移植后的缺血损伤 或缩短血管生成时间，但并未明显改善卵泡的存活率。 卵巢皮质片段移植后卵巢功能的时间维持在几个月至几年之间，Oktay 等报告了 59 例妇女通过卵巢片段移植术后，卵巢功能维持平均为( 36． 8±3．6) 个月。最新报道，卵巢功能维持时间最长者已超过7 年，但从现有的数据来看，移植后卵泡数保存良好的情况下，卵巢功能平均能维持4 ～ 5 年。从理论上讲，带血管蒂整体卵巢冷冻移植的可能优势在于:通过血管吻合移植术后卵巢可即刻恢复血供，使组织的缺血性损伤减小; 再者，由于整体卵巢携有更多的卵泡，因此有望长期保持卵巢功能。目前通过血管吻合的整体卵巢移植在许多动物模型和人身上均获得了成功。2002 年 Wang 等将7 只冻融后的大鼠卵巢、输卵管连子宫上段一起进行移植，结果有 4 只存活，且排卵功能恢复持续60 多天，其中有一只大鼠自然怀孕。2006 年Imhof 等通过微血管吻合术对冻融后9 只绵羊整体卵巢行原位自体移植，其中 4 只绵羊手术后恢复了黄体功能， 1 只绵羊在移植术后 545 天获得自然妊娠并活产一只健康小羊。术后 18 ～ 19 个月后 组织镜检发现有 6 只绵羊的卵巢基质结构基本保持完整。 2008 年Silber 等报道了在一对38 岁的同卵双胞胎姐妹间进行了整体卵巢移植，Silber 等在腹腔镜下从患者妹妹体内分离出带血管蒂卵巢，然后通过微型剖腹手术将供者与患者的卵巢静脉和卵巢动脉分别进行吻合，历经 100min 的缺血时间后，观察到外观正常的血液流经移植后的卵巢中。患者在术后101 天月经来潮，术后 427 天患者成功怀孕，并于 40 周后产下1 例健康女婴。因此，从技术上来说，大型哺乳动物和人类行带血管整体卵巢冷冻后通过显微血管吻合术对卵巢进行移植是可行的。但由于整体卵巢体积大，组织成分复杂，目前也没有标准的冷冻方案，加之微血管吻合技术困难。从目前现有的实验数据来看，冻融后整体卵巢移植后卵泡存活率低，有关冷冻移植后卵泡的存活率也存在较大差异。Martinez-Madrid 等报道，冻融后整体卵巢卵泡存活率为75．1%，目前尚缺乏整体人卵巢移植后其卵泡存活率的评估。而 Imhof 等道，绵羊整个卵巢冷冻移植后卵泡的存活率仅有1．7% ～7．6%。Courbiere 等对 5 只羊行新鲜整 体卵巢移植，有2 只恢复内分泌，并分别于移植后12 月和 25月后生产出下一代健康小羊，检测2 只羊的卵泡存活率分别 为0．5%和24．6%。推测移植后卵巢的寿命长短除了受冻 融过程所致的卵泡损失影响外，主要与移植后造成的卵泡大量丢失有关，而移植手术的时间长、手术技术不足及移植后 的血栓形成都可能是引起卵泡丢失的原因。目前整体卵巢冷冻移植仍处于实验性阶段，能否获得如理论分析认为的优势，还需更多的实验研究来验证。

 1 整体卵巢冷冻保护剂灌注

      整体卵巢取下后需立即行卵巢动脉插管，以一定的灌注速率向卵巢动脉注入肝素生理盐水以消除血细胞; 选用不同不同方式使组织渗入冷冻保护剂，目前主要有 3 种方式: 浸泡、灌注或两者结合; 最后选用不同的冷冻方法进行冷冻保存。最初对大鼠和小鼠整体卵巢冷冻是通过浸泡来达到冷冻保护剂的有效渗透，然后行无血管吻合整体卵巢移植。但浸泡的方法不适于卵巢体积大、纤维组织多的大型哺乳动物的整体卵巢冷冻。因此 Bedaiwy 等开始采用卵巢动脉插管行冷冻液灌注，冷冻保护剂通过卵巢脉管系统渗入卵巢内部各部分。但整体卵巢组织块相对较大，冷冻剂充分渗入卵巢各个部位需一定的灌注时间和速度，灌注过 程也是冷缺血的过程。随着灌注时间延长，一方面延长了缺 血时间，一方面也增加了冷冻剂的毒性损伤。各物种由于卵巢大小不等，最宜灌注时间和灌注速度也不同。在以往整体卵巢冷冻灌注研究中，不同研究有不同的灌注时间和速率。 Chen 等对12 只兔整体卵巢进行冷冻剂灌注15min，灌注速率为2．0 ～2．5ml/min，冷冻移植后有 10 只恢复内分泌功能。王晓娇等观察发现，灌注 30min 组( 冻融) 兔整体卵 巢卵泡存活率与新鲜组无差异，而灌注 5min 及 60min 组卵 泡存活率均下降。Courbiere 等对羊整体卵巢冷冻剂灌注 40min，灌注速率为 0．35ml/min，冻融移植后有下一代羊产生。Isachenko 等测定了牛整体卵巢的不同灌注速率对冷冻效果的影响，结果发现以 0．83ml/min、 0．42ml/min 灌注 60min 效果最好。Martinez-Madrid 等对人整体卵巢冷冻剂灌注5min，速率2．5ml/min后，再在冷冻剂中平衡10min， 灌注后卵泡数为 98． 1% 与新鲜对照组比较无差异。Wallin 等、Milenkovic 等对羊、Milan 等对人整体卵巢进行灌注，灌注时间均为30min，速率为 1 ～ 2ml/min( 80mmhg) 的方案，但因未对灌注后的卵巢进行评价，因此不知道该灌注方法具体效果如何。现有文献对各物种整体卵巢灌注的方案报道不一，因此还需更多实验数据来寻求适和各物种整体卵巢灌注的方案。

2 整体卵巢冷冻方法的选择

      目前用于卵巢组织冷冻的方法主要有程序化冷冻和玻璃化冷冻两种。两种方法均成功用于卵巢皮质片段冷冻。 而对于整体卵巢冷冻，不同实验室选用了不同的冷冻方法来进行。目前仍缺乏足够的实验研究结果来支持何种方法更适合用于整体卵巢冷冻。程序化冷冻法是采用冷冻仪按设置的程序进行冷冻，其在胚胎、卵巢组织的冷冻中都已经成 功运用，且效果稳定，但用于整体卵巢冷冻的效果还需要进一步确认。Martinez-Madrid 等利用程序化冷冻方法对人整个卵巢进行冷冻后观察显示，冻融后卵泡的存活率为75．1%，与新鲜卵巢组和预平衡后( 未冻融) 相比有差异， Martinez 等比较了卵巢冻融组、新鲜组和预平衡后组的初级卵泡和血管的超微结构，发现 3 组之间相比无差异，冻融组的卵泡和血管的超微结构保存良好。Milenkovic 等用 两种程序化冷冻方案( 1． 5mol/L DMSO 和 1． 5 mol/L RA) 对羊整体卵巢的冷冻效果进行了比较，结果显示 DMSO 组冻融后卵巢产生的 cAMP 和孕激素稍高于 RA 组，且 DMSO 组卵泡细胞培养后所产生的孕激素同样高于 RA 组，同时测定了 小卵泡密度并进行组织学检查，发现 DMSO 组和 RA 组的卵泡密度分别为17%和7%。冷冻保护剂安全性评价显示，冷冻剂灌注后 DMSO 组的卵泡组织学结构在光学显微镜下未发现破坏，RA 组卵泡及其间质细胞有水肿和形态改变。由此认为，DMSO 作为冷冻保护剂效果优于 RA。Zhang 等还测定了不同的降温速率和植冰温度对牛整个卵巢程序化 冷冻效果的影响，发现以0．5℃ /min 的降温速率和－5℃植冰组合，卵泡的存活率最高为76．9%。 玻璃化冻存方法较多，没有确定的玻璃化液标准配方，不同的实验所用的玻璃化方案不同。Courbiere 等比较了两种玻璃化冷冻方案对羊整体卵巢冷冻的冷冻效果并评价了 VS1 和 VS4 冷冻保护剂的安全性。发现两种方案对卵泡 活力、初级卵母细胞的密度及组织形态学和血管的毒性的影响与新鲜卵巢组相比无差异。随后对这两种方案冷冻后的卵巢进行了评定。研究证明，VS1、VS4 方案冻融后组织学检 查正常初级卵泡的比例分别为 25． 2% 和 53． 5%，并且前者有更多的卵泡细胞质和核损伤。由此认为卵巢可耐受玻璃化冻存法冷冻保护剂的高浓度，并且证明了 VS4 方案优于 VS1。 现上述两种方法均处于整体卵巢冷冻的实验研究阶段。 程序化冷冻原理是采用较低浓度的冷冻液保护剂，在程序冷冻仪的控制下缓慢降温使细胞在冷冻液中逐渐脱水，细胞内溶质浓度逐渐增加，从而防止细胞内冰晶的形成。但此法打破了细胞内外的平衡状态，复温时出现细胞内液体重结晶。 玻璃化冷冻则要求高浓度的冷冻保护液，细胞内迅速脱水，防止了细胞内外的冰晶形成，有利于卵巢组织中基质细胞的保存。而 Mundel 等已发现，细胞外基质的碎片抑制微血管生成，促进微血管退化。傅锦媚等比较了玻璃化法 和程序冷冻法对人卵巢组织血管内皮生长因子表达及血管生成的影响，发现前者较后者能更好的保存卵巢组织间质细胞和细胞外基质。由此推测，玻璃化冷冻可能较程序化冷冻更适合用于整体卵巢冷冻。Zhang 等比较了玻璃化冷冻和程序化冷冻两种方法对牛卵巢冷冻保存的效果，程序化法和玻璃化法冻融整个卵巢后形态学检测正常初级卵泡分别为42． 9%和59． 3%，认为玻璃化冷冻整体卵巢优于程序化冷冻。由此推测，对整体卵巢冷冻方法的选择，玻璃化冷冻可能优于程序化冷冻。但同时也有认为程序化冷冻效果优于玻璃化法的报道，Milenkovic 等分别利用玻璃化冷冻法和程序化冷冻法测定了高浓度( 7mol/L DMSO) 和低浓度 ( 1．5mol/L DMSO) 冷冻保护剂对大鼠整体卵巢的冷冻效果的影响，发现各组冷冻效果并不十分理想，相较而言低浓度 ( 1．5mol/L DMSO) 的程序化冷冻效果稍好。推测该试验造成冷冻效果不佳的原因与冷冻保护剂组成有关:(1) 采用的冷冻保护剂单一; (2) 采用的浓度差距太大，浓度过低和过高。不过由此也证明过高浓度的冷冻保护剂毒性较强。值得注意的是，目前各试验研究所采用玻璃化冷冻法其冷冻液浓度并不很高。Xu 等报道，豚鼠的完整卵巢用 1．5mol/L DMSO 程序化冷冻较玻璃化冷冻效果好。选择何种方法对整体卵巢进行冷冻，目前仍有争议。各实验报道不一致的原因可能是因实验动物和冷冻方案不同，故得出结论也不尽相同。

3 整体卵巢移植

       卵巢移植方法主要有卵巢血管吻合法和非血管吻合法两种。不管用哪种方法，卵巢移植后能否存活得关键在于卵巢能否及时恢复血供。Bagis 等用非血管吻合方式对8 只小鼠行同种异体原位小鼠整体卵巢，术后有 7 只小鼠怀孕共产 仔22 只。Petroianu 等也用非血管吻合方法移植兔完整卵巢， 3 个月后卵泡刺激素和黄体生成素恢复正常，交配后有半数兔怀孕。Courbiere 等利用微血管吻合术对绵羊完整卵巢行自体原位移植，其中新鲜卵巢移植组( n=5) 有 2 只绵羊 获得自然妊娠并活产，其余绵羊也先后恢复了内分泌功能，玻璃化冷冻组有1 只绵羊卵巢移植术后血管正常并在6 个月后恢复了卵巢功能。王金华等对 8 例年轻宫颈癌患者行腋窝血管( 7 例胸背动静脉，1 例胸壁动脉) 吻合的整体卵巢移植术，3 个月后有2 例 E2 水平升高，FSH、LH 下降，逐渐恢复正常， 6 个月后 5 例逐渐恢复正常， 1 例 9 个月后恢复正常。 Silber 等利用血管吻合在同卵双生姐妹间行人类整体卵巢移植，术后受术者成功怀孕并产下一名女婴。由此证明，整体卵巢采用两种方法进行移植都是可行的。比较经显微外科血管吻合术进行卵巢移植和非血管吻合卵巢移植，发现前者存 活卵泡数明显多于后者。通过血管吻合有助于尽快回复卵巢血供，减少缺血时间。大型哺乳动物和人类的卵巢体积相对较大，短时间内不容易建立良好的血供，故宜采用显微外科技术的血管吻合来行整体卵巢移植。移植方式分为自体移植和异体移植。异体移植根据种属可分为同种异体移植和异种异体移植。根据移植位点可分成原位移植和异位移植。自体移植可避免排斥反应且无伦理限制，自体移植可采用原位和异位移植，因原位移植更符合生理，不仅适合卵巢发育，且能自然妊娠。很多实验研究如鼠、羊均采用自体原位移植均获得成功。自体异位移植可使患者恢复内分泌功能，但需行辅助生殖技术来获得妊娠。王金华等对年轻宫颈癌患者行自体整体卵巢腋窝移植，移植后患者全部恢复了内分泌功能。 在异体移植研究中，Nichols-Burns 等建立了异种异体移植动物模型，将猪卵巢( n=10) 动、静脉分别与裸鼠的股动、静脉行端侧吻合，术后1周、 2周和 4周后取出移植物进行评估，发现移植组有7 只卵巢与新鲜组比较卵巢大小无差异，其余 3 只卵巢发生萎缩。组织学观察发现，移植组中 6 只卵巢脉管系统保持完整，卵巢间质结构大部分保持完整，余 4 只卵巢 血管发生损伤并有血栓形成，卵巢间质纤维化且有炎细胞浸 润。移植组卵泡计数较新鲜组显著减少，下降了 64%。异体移植可避免肿瘤患者将残留的肿瘤细胞再带入体内，也适用于卵巢早衰及卵巢癌患者，但由于伦理问题( 例如孩子的归 属) 及排斥反应，限制了其发展。因此只要能满足自体移植的条件，多数采用自体移植。

 4 存在的问题及展望

      卵巢组织冷冻移植的主要问题在于移植后待新生血管生成期间由于缺血造成的大量的卵泡丢失，从理论上看，带血管蒂的整体卵巢移植则可通过直接对血管进行吻合而减少组织的缺血损伤，从而有望保存更多的卵泡而使卵巢功能得以长久维持。现有研究结果表明，通过血管吻合的整体卵巢移植并没有获得更高的卵泡存活率，原因在于:(1) 整体卵巢冷冻困难。由于整个卵巢的卵巢组织含各级卵泡和间质细胞，各种细胞适宜的冷冻条件不尽相同，因此要达到良好的冷冻效果是其难点之一。对于整体卵巢冷冻不管是程序化冷冻还是玻璃化冷冻都还处在实验室水平，未有标准的冷冻方案。 (2) 冷冻前对整体卵巢的灌注不可避免地对卵巢组织和微血管有带来损伤加之术后的血栓形成造成的卵泡大量损失，使得移植术后卵泡数量显著减少而减弱了整体卵巢移植可能带来的获益。(3) 卵巢移植后卵泡的存活率也受显微外科血管吻合手术技术和手术时间的影响，这无疑对术者的手术技巧提出更高要求。(4) 整体卵巢组织虽可保存更多的卵泡，与此同时也使得卵巢组织中携有残留癌细胞的风险加大，因此对移植物的筛检技术要求更高。整体卵巢冷冻移植可使接受 放化疗的女性肿瘤患者、卵巢功能早衰或染色体异常不能生育的患者长期获益，并可弥补或取代卵巢皮质组织移植不能长时间维持女性生殖内分泌的缺点。但要获得整体卵巢冷冻移植的成功，需进一步解决上述问题。